Produk
Kit Deteksi Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR untuk 2019-nCoV
Penggunaan yang diharapkan
Kit ini digunakan untuk deteksi kualitatif virus corona baru (2019-nCoV) menggunakan usapan tenggorokan, usapan nasofaring, cairan bilas bronkoalveolar, dahak. Hasil deteksi produk ini hanya untuk referensi klinis dan tidak boleh digunakan sebagai satu-satunya bukti untuk diagnosis dan perawatan klinis. Analisis kondisi yang komprehensif direkomendasikan dikombinasikan dengan manifestasi klinis pasien dan uji laboratorium lainnya.
Prinsip inspeksi
Kit ini didasarkan pada teknologi RT-PCR satu langkah. Faktanya, gen ORF1ab dan N virus corona baru 2019 (2019-nCoV) dipilih sebagai daerah target amplifikasi. Primer spesifik dan probe fluoresensi (probe gen N diberi label FAM dan probe ORF1ab diberi label HEX) dirancang untuk mendeteksi RNA virus corona tipe baru 2019 dalam sampel. Kit ini juga mencakup sistem deteksi kontrol internal endogen (probe gen kontrol internal diberi label CY5) untuk memantau proses pengambilan sampel, amplifikasi RNA dan PCR, sehingga mengurangi hasil negatif palsu.
Komponen utama
| Komponen | Volume(48T/Perlengkapan) |
| Larutan reaksi RT-PCR | 96 µl (1,5 juta liter) |
| campuran probe TaqMan primer nCOV（ORF1ab, Gen N, Gen RnaseP） | 864 µl (1,2 juta liter) |
| Kontrol negatif | 1500 µl (1,5 juta liter) |
| nCOV Kontrol positif（l ORF1ab N Gene） | 1500 µl (1,5 juta liter) |
Reagen sendiri: Reagen ekstraksi atau pemurnian RNA. Kontrol negatif/positif: Kontrol positif adalah RNA yang mengandung fragmen target, sedangkan kontrol negatif adalah air bebas asam nukleat. Selama penggunaan, reagen tersebut harus ikut serta dalam ekstraksi dan harus dianggap infeksius. Reagen tersebut harus ditangani dan dibuang sesuai dengan peraturan yang relevan.
Gen referensi internal adalah gen RnaseP manusia.
Kondisi penyimpanan dan tanggal kedaluwarsa
-20±5℃, hindari pembekuan dan pencairan berulang lebih dari 5 kali, berlaku selama 6 bulan.
Instrumen yang berlaku
Dengan FAM / HEX / CY5 dan instrumen PCR fluoresensi multi-saluran lainnya.
Persyaratan spesimen
1. Jenis spesimen yang berlaku: usap tenggorokan, usap nasofaring, cairan lavage bronkoalveolar, dahak。
2.Pengumpulan spesimen (teknik aseptik)
Usap faring: Bersihkan amandel dan dinding faring posterior dengan dua usap sekaligus, lalu rendam kepala usap ke dalam tabung reaksi berisi larutan sampel.
Dahak: Setelah pasien batuk dalam, kumpulkan dahak batuk dalam tabung reaksi tutup ulir yang berisi larutan pengambilan sampel; cairan lavage bronkoalveolar: Pengambilan sampel oleh tenaga medis. 3. Penyimpanan dan pengangkutan sampel
Spesimen untuk isolasi virus dan pengujian RNA harus diuji sesegera mungkin. Spesimen yang dapat dideteksi dalam waktu 24 jam dapat disimpan pada suhu 4℃; spesimen yang tidak dapat dideteksi dalam waktu 24 jam dapat disimpan pada suhu 4℃.
jam harus disimpan pada suhu -70℃ atau di bawahnya (jika tidak ada kondisi penyimpanan -70℃, maka harus disimpan
disimpan sementara pada lemari es bersuhu -20℃). Spesimen harus menghindari pembekuan dan pencairan berulang selama pengangkutan. Spesimen harus dikirim ke laboratorium sesegera mungkin setelah pengambilan. Jika sampel perlu diangkut dalam jarak jauh, penyimpanan dengan es kering direkomendasikan.
Metode Pengujian
1 Pengolahan sampel dan ekstraksi RNA (area pengolahan sampel)
Disarankan untuk mengambil sampel cairan sebanyak 200μl untuk ekstraksi RNA. Untuk langkah ekstraksi terkait, lihat petunjuk kit ekstraksi RNA komersial. Baik negatif maupun negatif
Kontrol dalam kit ini dilibatkan dalam ekstraksi.
2 Persiapan reagen PCR (area persiapan reagen)
2.1 Keluarkan semua komponen dari kit dan cairkan serta campurkan pada suhu ruangan. Lakukan sentrifus pada kecepatan 8.000 rpm selama beberapa detik sebelum digunakan; hitung jumlah reagen yang dibutuhkan, dan sistem reaksi disiapkan seperti yang ditunjukkan pada tabel berikut:
| Komponen | Penyajian N (sistem 25µl) |
| campuran probe TaqMan primer nCOV | 18 µl × N |
| Larutan reaksi RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = jumlah sampel yang diuji + 1 (kontrol negatif) + 1 (nCOVkontrol positif) | |
2.2 Setelah komponen tercampur secara menyeluruh, sentrifus selama beberapa saat agar seluruh cairan pada dinding tabung jatuh ke dasar tabung, lalu alikuot sistem amplifikasi 20 µl ke dalam tabung PCR.
3 Pengambilan sampel (area persiapan spesimen)
Tambahkan 5μl kontrol negatif dan positif setelah ekstraksi. RNA sampel yang akan diuji ditambahkan ke tabung reaksi PCR.
Tutup tabung dengan rapat dan sentrifus pada kecepatan 8.000 rpm selama beberapa detik sebelum memindahkannya ke area deteksi amplifikasi.
4 Amplifikasi PCR (area deteksi yang diperkuat)
4.1 Letakkan tabung reaksi di sel sampel instrumen, dan atur parameternya sebagai berikut:
| panggung | Siklus nomor | Suhusuhu udara | Waktu | koleksilokasi |
| Baliktranskripsi | 1 | 42 | 10 menit | - |
| Pra-denaturasin | 1 | 95 | 1 menit | - |
| Siklus | 45 | 95 | 15 detik | - |
| 60 | usia 30an | pengumpulan data |
Pemilihan saluran deteksi instrumen: Pilih saluran FAM、HEX、CY5 untuk sinyal fluoresensi. Untuk referensi fluoresensi NONE, jangan pilih ROX.
5 Analisis hasil (Silakan merujuk pada petunjuk percobaan masing-masing instrumen untuk pengaturan)
Setelah reaksi, simpan hasilnya. Setelah analisis, sesuaikan nilai awal, nilai akhir, dan nilai ambang batas garis dasar sesuai dengan gambar (pengguna dapat menyesuaikan sesuai dengan situasi aktual, nilai awal dapat diatur ke 3~15, nilai akhir dapat diatur ke 5~20, penyesuaian) dalam grafik logaritmik Pada ambang batas jendela, garis ambang batas berada dalam fase logaritmik, dan kurva amplifikasi kontrol negatif adalah garis lurus atau di bawah garis ambang batas).
6 Kontrol kualitas（Kontrol prosedural disertakan dalam pengujian） Kontrol negatif: Tidak ada kurva amplifikasi yang jelas untuk saluran deteksi FAM, HEX, CY5
Kontrol positif COV: kurva amplifikasi saluran deteksi FAM dan HEX yang jelas, nilai Ct≤32, tetapi tidak ada kurva amplifikasi saluran CY5;
Persyaratan di atas harus dipenuhi secara bersamaan dalam percobaan yang sama; jika tidak, percobaan tersebut tidak valid dan perlu diulang.
7 Penentuan hasil.
7.1 Jika tidak ada kurva amplifikasi atau nilai Ct> 40 di saluran FAM dan HEX sampel uji, dan ada kurva amplifikasi di saluran CY5, dapat dinilai bahwa tidak ada RNA virus corona baru 2019 (2019-nCoV) dalam sampel;
.2 Jika sampel uji memiliki kurva amplifikasi yang jelas di saluran FAM dan HEX, dan nilai Ct ≤40, dapat dinilai bahwa sampel tersebut positif terhadap virus corona baru 2019 (2019-nCoV).
7.3 Jika sampel uji memiliki kurva amplifikasi yang jelas hanya di satu saluran FAM atau HEX, dan nilai Ct ≤40, dan tidak ada kurva amplifikasi di saluran lainnya, hasilnya perlu diuji ulang. Jika hasil pengujian ulang konsisten, sampel dapat dinilai positif untuk yang baru
virus corona 2019 (2019-nCoV). Jika hasil tes ulang negatif, dapat dipastikan sampel tersebut negatif terhadap virus corona baru 2019 (2019-nCoV).
Nilai penilaian positif
Metode kurva ROC digunakan untuk menentukan nilai referensi CT kit dan nilai referensi kontrol internal adalah 40.
Interpretasi hasil tes
1. Setiap percobaan harus diuji untuk kontrol negatif dan positif. Hasil pengujian hanya dapat ditentukan ketika kontrol memenuhi persyaratan kontrol kualitas.
2.Ketika saluran deteksi FAM dan HEX positif, hasil dari saluran CY5 (saluran kontrol internal) mungkin negatif karena persaingan sistem.
3.Jika hasil kontrol internal negatif, jika saluran deteksi FAM dan HEX tabung reaksi juga negatif, berarti sistem dinonaktifkan atau operasinya salah, pengujian tidak valid. Oleh karena itu, sampel perlu diuji ulang.
