Produk
Kit Deteksi Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR untuk 2019-nCoV
Penggunaan yang diharapkan
Kit ini digunakan untuk deteksi kualitatif virus corona baru (2019-nCoV) menggunakan usap tenggorokan, usap nasofaring, cairan bilas bronkoalveolar, dahak. Hasil deteksi produk ini hanya untuk referensi klinis, dan tidak boleh digunakan sebagai satu-satunya bukti untuk diagnosis dan pengobatan klinis. Analisis komprehensif terhadap kondisi ini direkomendasikan dalam kombinasi dengan manifestasi klinis pasien dan tes laboratorium lainnya.
Prinsip inspeksi
Kit ini didasarkan pada teknologi RT-PCR satu langkah.Faktanya, gen ORF1ab dan N dari virus corona baru (2019-nCoV) tahun 2019 dipilih sebagai wilayah target amplifikasi.Primer spesifik dan probe fluoresen (probe gen N diberi label FAM dan probe ORF1ab diberi label HEX) dirancang untuk mendeteksi RNA virus corona tipe baru 2019 dalam sampel.Kit ini juga mencakup sistem deteksi kontrol internal endogen (probe gen kontrol internal berlabel CY5) untuk memantau proses pengumpulan sampel, amplifikasi RNA dan PCR, sehingga mengurangi hasil negatif palsu.
Komponen utama
| Komponen | Volume（48T/Perangkat） |
| Solusi reaksi RT-PCR | 96µl |
| campuran probe TaqMan primer nCOV（ORF1ab, Gen N, Gen RnaseP） | 864µl |
| Kontrol negatif | 1500µl |
| nCOV Kontrol positif （l ORF1ab N Gene） | 1500µl |
Reagen sendiri: reagen ekstraksi atau pemurnian RNA.Kontrol negatif/positif: Kontrol positif adalah RNA yang mengandung fragmen target, sedangkan kontrol negatif adalah air bebas asam nukleat.Selama penggunaan, mereka harus berpartisipasi dalam ekstraksi dan harus dianggap menular.Bahan-bahan tersebut harus ditangani dan dibuang sesuai dengan peraturan terkait.
Gen referensi internal adalah gen RnaseP manusia.
Kondisi penyimpanan dan tanggal kedaluwarsa
-20±5℃, hindari pembekuan dan pencairan berulang lebih dari 5 kali, berlaku selama 6 bulan.
Instrumen yang berlaku
Dengan FAM / HEX / CY5 dan instrumen PCR neon multi-saluran lainnya.
Persyaratan spesimen
1. Jenis spesimen yang berlaku: usap tenggorokan, usap nasofaring, cairan bilas bronkoalveolar, dahak。
2. Pengumpulan spesimen (teknik aseptik）
Usap faring: Usap amandel dan dinding faring posterior dengan dua usap sekaligus, kemudian rendam kepala usap ke dalam tabung reaksi yang berisi larutan sampel.
Dahak: Setelah pasien batuk dalam, kumpulkan dahak yang terbatuk ke dalam tabung reaksi bertutup ulir yang berisi larutan sampel;cairan lavage bronkoalveolar：Pengambilan sampel oleh profesional medis.3. Penyimpanan dan pengangkutan sampel
Spesimen untuk isolasi virus dan pengujian RNA harus diuji sesegera mungkin.Spesimen yang dapat dideteksi dalam waktu 24 jam dapat disimpan pada suhu 4℃;mereka yang tidak dapat dideteksi dalam waktu 24
jam harus disimpan pada suhu -70℃atau lebih rendah (jika tidak ada kondisi penyimpanan -70℃, jam tersebut harus disimpan
disimpan sementara di lemari es -20℃).Spesimen harus menghindari pembekuan dan pencairan berulang kali selama pengangkutan.Spesimen harus dikirim ke laboratorium sesegera mungkin setelah pengambilan.Jika sampel perlu diangkut dalam jarak jauh, disarankan untuk menyimpan es kering.
Metode tes
1 Pemrosesan sampel dan ekstraksi RNA (area pemrosesan sampel)
Disarankan untuk mengambil 200μl sampel cair untuk ekstraksi RNA.Untuk langkah-langkah ekstraksi terkait, lihat petunjuk kit ekstraksi RNA komersial.Baik yang negatif maupun negatif
kontrol dalam kit ini terlibat dalam ekstraksi.
2 Persiapan reagen PCR (area persiapan reagen)
2.1 Keluarkan semua komponen dari kit dan cairkan serta campur pada suhu kamar.Centrifuge pada 8.000 rpm selama beberapa detik sebelum digunakan;hitung jumlah reagen yang diperlukan, dan sistem reaksi dibuat seperti yang ditunjukkan pada tabel berikut:
| Komponen | N porsi (sistem 25µl) |
| campuran probe TaqMan primer nCOV | 18 μl × N |
| Solusi reaksi RT-PCR | 2 μl × N |
| *N = jumlah sampel yang diuji + 1 (kontrol negatif) + 1 (nCOVkontrol positif) | |
2.2 Setelah komponen tercampur rata, sentrifugasi sebentar agar semua cairan di dinding tabung turun ke dasar tabung, lalu alikuot 20 μl sistem amplifikasi ke dalam tabung PCR.
3 Pengambilan sampel (area persiapan spesimen)
Tambahkan 5μl kontrol negatif dan positif setelah ekstraksi.RNA sampel yang akan diuji dimasukkan ke dalam tabung reaksi PCR.
Tutup tabung dengan rapat dan sentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama beberapa detik sebelum memindahkannya ke area deteksi amplifikasi.
4 Amplifikasi PCR (area deteksi yang diperkuat)
4.1 Tempatkan tabung reaksi di sel sampel instrumen, dan atur parameternya sebagai berikut:
| panggung | Siklus nomor | Suhu(°C) | Waktu | koleksilokasi |
| Baliktranskripsi | 1 | 42 | 10 menit | - |
| Pra-denaturasin | 1 | 95 | 1 menit | - |
| Siklus | 45 | 95 | 15 detik | - |
| 60 | 30an | pengumpulan data |
Pemilihan saluran deteksi instrumen: Pilih saluran FAM、HEX、CY5 untuk sinyal fluoresensi.Untuk referensi neon TIDAK ADA, mohon jangan memilih ROX.
5 Analisis hasil (Silakan lihat petunjuk percobaan masing-masing instrumen untuk pengaturan)
Setelah reaksi, simpan hasilnya.Setelah analisis, sesuaikan nilai awal, nilai akhir, dan nilai ambang batas garis dasar sesuai dengan gambar (pengguna dapat menyesuaikan sesuai dengan situasi aktual, nilai awal dapat diatur ke 3~15, nilai akhir dapat diatur ke 5~20, penyesuaian) pada grafik logaritmik Di ambang jendela, garis ambang berada dalam fase logaritmik, dan kurva amplifikasi kontrol negatif adalah garis lurus atau di bawah garis ambang batas).
6 Kontrol kualitas (Kontrol prosedural disertakan dalam pengujian) Kontrol negatif: Tidak ada kurva amplifikasi yang jelas untuk saluran deteksi FAM, HEX, CY5n
Kontrol positif COV: kurva amplifikasi yang jelas pada saluran deteksi FAM dan HEX, nilai Ct≤32, tetapi tidak ada kurva amplifikasi saluran CY5;
Persyaratan di atas harus dipenuhi secara bersamaan dalam percobaan yang sama;jika tidak, eksperimen tersebut tidak valid dan perlu diulang.
7 Penentuan hasil.
7.1 Jika tidak terdapat kurva amplifikasi atau nilai Ct > 40 pada saluran FAM dan HEX sampel uji, serta terdapat kurva amplifikasi pada saluran CY5, maka dapat dinilai tidak terdapat virus corona baru 2019 (2019-nCoV) RNA dalam sampel;
.2 Jika sampel uji memiliki kurva amplifikasi yang jelas pada saluran FAM dan HEX, dan nilai Ct ≤40, maka dapat dinilai bahwa sampel tersebut positif mengidap virus corona baru 2019 (2019-nCoV).
7.3 Jika sampel uji mempunyai kurva amplifikasi yang jelas hanya pada satu saluran FAM atau HEX, dan nilai Ct ≤40, serta tidak terdapat kurva amplifikasi pada saluran lainnya, maka hasilnya perlu diuji ulang.Jika hasil tes ulang konsisten maka sampel dapat dinilai positif baru
virus corona 2019 (2019-nCoV).Jika hasil tes ulang negatif, maka dapat dinilai sampel tersebut negatif virus corona baru 2019 (2019-nCoV).
Nilai penilaian positif
Metode kurva ROC digunakan untuk menentukan nilai referensi CT kit dan nilai referensi pengendalian internal adalah 40.
Interpretasi hasil tes
1.Setiap percobaan harus diuji untuk kontrol negatif dan positif.Hasil pengujian hanya dapat ditentukan bila pengendalian memenuhi persyaratan pengendalian mutu
2.Ketika saluran deteksi FAM dan HEX positif, hasil dari saluran CY5 (saluran kontrol internal) mungkin negatif karena persaingan sistem.
3. Bila hasil pengendalian internal negatif, jika saluran deteksi FAM dan HEX tabung reaksi juga negatif, berarti sistem dinonaktifkan atau pengoperasiannya salah, maka pengujian tidak valid.Oleh karena itu, sampel perlu diuji ulang.
