Produk
Kit Deteksi Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR untuk 2019-nCoV
Penggunaan yang diharapkan
Kit ini digunakan untuk deteksi kualitatif new coronavirus (2019-nCoV) menggunakan swab tenggorokan, swab nasofaring, cairan lavage bronchoalveolar, dahak.Hasil deteksi produk ini hanya untuk referensi klinis, dan tidak boleh digunakan sebagai satu-satunya bukti untuk diagnosis dan pengobatan klinis. Analisis kondisi yang komprehensif direkomendasikan dalam kombinasi dengan manifestasi klinis pasien dan tes laboratorium lainnya.
Prinsip pemeriksaan
Kit ini didasarkan pada teknologi RT-PCR satu langkah.Faktanya, gen ORF1ab dan N coronavirus baru (2019-nCoV) 2019 dipilih sebagai daerah target amplifikasi.Probe primer dan fluoresen spesifik (probe gen N diberi label dengan FAM dan probe ORF1ab diberi label dengan HEX) dirancang untuk mendeteksi RNA virus corona tipe baru 2019 dalam sampel.Kit ini juga mencakup sistem deteksi kontrol internal endogen (probe gen kontrol internal berlabel CY5) untuk memantau proses pengumpulan sampel, amplifikasi RNA dan PCR, sehingga mengurangi hasil negatif palsu.
Komponen utama
| Komponen | Volume（48T/Kit） |
| larutan reaksi RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture（ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene） | 864µl |
| Kontrol negatif | 1500µl |
| Kontrol Positif nCOV（l ORF1ab N Gene） | 1500µl |
Reagen sendiri: Ekstraksi RNA atau reagen pemurnian.Kontrol negatif/positif: Kontrol positif adalah RNA yang mengandung fragmen target, sedangkan kontrol negatif adalah air bebas asam nukleat.Selama penggunaan, mereka harus berpartisipasi dalam ekstraksi dan harus dianggap menular.Mereka harus ditangani dan dibuang sesuai dengan peraturan yang relevan.
Gen referensi internal adalah gen RnaseP manusia.
Kondisi penyimpanan dan tanggal kedaluwarsa
-20 ± 5 ℃, hindari pembekuan berulang dan pencairan lebih dari 5 kali, berlaku selama 6 bulan.
Instrumen yang berlaku
Dengan FAM / HEX / CY5 dan instrumen PCR neon multi-saluran lainnya.
Persyaratan spesimen
1. Jenis spesimen yang berlaku: penyeka tenggorokan, penyeka nasofaring, cairan lavage bronkoalveolar, dahak。
2. Pengumpulan spesimen (teknik aseptik）
Usap faring: Seka amandel dan dinding faring posterior dengan dua swab secara bersamaan, lalu rendam kepala swab dalam tabung reaksi yang berisi larutan pengambilan sampel
Sputum: Setelah pasien mengalami batuk yang dalam, kumpulkan dahak yang dibatukkan ke dalam tabung uji bertutup ulir yang berisi larutan sampel;cairan lavage bronkoalveolar：Pengambilan sampel oleh profesional medis.3. Penyimpanan dan transportasi sampel
Spesimen untuk isolasi virus dan pengujian RNA harus diuji sesegera mungkin.Spesimen yang dapat dideteksi dalam 24 jam dapat disimpan pada suhu 4℃;yang tidak dapat dideteksi dalam 24
jam harus disimpan pada -70 ℃ atau di bawahnya (jika tidak ada kondisi penyimpanan -70 ℃, seharusnya
disimpan sementara di -20 ℃ kulkas).Spesimen harus menghindari pembekuan dan pencairan berulang selama transportasi.Spesimen harus dikirim ke laboratorium sesegera mungkin setelah pengambilan.Jika sampel perlu diangkut dalam jarak jauh, disarankan untuk menyimpan es kering.
Metode tes
1 Pemrosesan sampel dan ekstraksi RNA (area pemrosesan sampel)
Dianjurkan untuk mengambil 200μl sampel cair untuk ekstraksi RNA.Untuk langkah-langkah ekstraksi terkait, lihat petunjuk kit ekstraksi RNA komersial.Baik yang negatif maupun negatif
kontrol dalam kit ini terlibat dalam ekstraksi.
2 Persiapan reagen PCR (area persiapan reagen)
2.1 Hapus semua komponen dari kit dan cairkan dan campur pada suhu kamar.Centrifuge pada 8.000 rpm selama beberapa detik sebelum digunakan;menghitung jumlah reagen yang dibutuhkan, dan sistem reaksi disiapkan seperti yang ditunjukkan pada tabel berikut:
| Komponen | Penyajian N (sistem 25µl) |
| campuran probe TaqMan primer nCOV | 18 µl × N |
| larutan reaksi RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = jumlah sampel yang diuji + 1 (kontrol negatif) + 1 (nCOVkontrol positif) | |
2.2 Setelah mencampur komponen secara menyeluruh, centrifuge sebentar untuk membiarkan semua cairan di dinding tabung jatuh ke dasar tabung, lalu alikuot sistem amplifikasi 20 µl ke dalam tabung PCR.
3 Sampling (tempat persiapan spesimen)
Tambahkan 5μl kontrol negatif dan positif setelah ekstraksi.RNA sampel yang akan diuji dimasukkan ke dalam tabung reaksi PCR.
Tutup tabung dengan rapat dan sentrifus pada 8.000 rpm selama beberapa detik sebelum memindahkannya ke area deteksi amplifikasi.
4 amplifikasi PCR (area deteksi yang diperkuat)
4.1 Tempatkan tabung reaksi di sel sampel instrumen, dan atur parameternya sebagai berikut:
| panggung | Siklus nomor | Suhu(°C) | Waktu | koleksilokasi |
| Baliktranskripsi | 1 | 42 | 10 menit | - |
| Pra-denaturasin | 1 | 95 | 1 menit | - |
| Siklus | 45 | 95 | 15 detik | - |
| 60 | 30-an | pengumpulan data |
Pemilihan saluran deteksi instrumen: Pilih saluran FAM、HEX、CY5 untuk sinyal fluoresensi.Untuk referensi neon TIDAK ADA, harap jangan memilih ROX.
5 Analisis hasil (Silakan lihat instruksi eksperimental dari setiap instrumen untuk pengaturan)
Setelah reaksi, simpan hasilnya.Setelah analisis, sesuaikan nilai awal, nilai akhir, dan nilai ambang dasar sesuai dengan gambar (pengguna dapat menyesuaikan sesuai dengan situasi aktual, nilai awal dapat diatur ke 3 ~ 15, nilai akhir dapat diatur ke 5 ~ 20, penyesuaian) dalam grafik logaritmik Di ambang jendela, garis ambang berada dalam fase logaritmik, dan kurva amplifikasi dari kontrol negatif adalah garis lurus atau di bawah garis ambang).
6 Kontrol kualitas（Kontrol prosedural disertakan dalam pengujian） Kontrol negatif: Tidak ada kurva amplifikasi yang jelas untuk saluran deteksi FAM, HEX, CY5n
Kontrol positif COV: kurva amplifikasi yang jelas dari saluran deteksi FAM dan HEX, nilai Ct≤32, tetapi tidak ada kurva amplifikasi saluran CY5;
Persyaratan di atas harus dipenuhi secara bersamaan dalam percobaan yang sama;jika tidak, eksperimen tersebut tidak valid dan perlu diulang.
7 Penentuan hasil.
7.1 Jika tidak ada kurva amplifikasi atau nilai Ct > 40 pada saluran FAM dan HEX dari sampel uji, dan tidak ada kurva amplifikasi pada saluran CY5, dapat dinilai tidak ada coronavirus baru 2019 (2019-nCoV) RNA dalam sampel;
.2 Jika sampel uji memiliki kurva amplifikasi yang jelas pada saluran FAM dan HEX, dan nilai Ct ≤40, dapat dinilai bahwa sampel tersebut positif untuk coronavirus baru 2019 (2019-nCoV).
7.3 Jika sampel uji memiliki kurva amplifikasi yang jelas hanya di satu saluran FAM atau HEX, dan nilai Ct ≤40, dan tidak ada kurva amplifikasi di saluran lain, hasilnya perlu diuji ulang.Jika hasil tes ulang konsisten, sampel dapat dinilai positif untuk yang baru
virus corona 2019 (2019-nCoV).Jika hasil tes ulang negatif, maka dapat dinilai bahwa sampel tersebut negatif untuk 2019 new coronavirus (2019-nCoV).
Nilai penilaian positif
Metode kurva ROC digunakan untuk menentukan nilai CT referensi kit dan nilai referensi kontrol internal adalah 40.
Interpretasi hasil tes
1.Setiap percobaan harus diuji untuk kontrol negatif dan positif.Hasil pengujian hanya dapat ditentukan ketika kontrol memenuhi persyaratan kontrol kualitas
2.Ketika saluran deteksi FAM dan HEX positif, hasil dari saluran CY5 (saluran kontrol internal) mungkin negatif karena kompetisi sistem.
3.Ketika hasil kontrol internal negatif, jika saluran deteksi FAM dan HEX tabung uji juga negatif, berarti sistem dinonaktifkan atau operasinya salah, t pengujiannya tidak valid.Oleh karena itu, sampel perlu diuji ulang.
